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蘇州組織定量PCR哪家好

來源: 發布時間:2023-08-08

Real-time PCR:使用Real-time PCR進行基因檢測,被普遍應用于病毒和病原菌檢測、轉基因食品檢測、遺傳病基因檢測等領域。一般首先需要利用專業使用的試劑盒從待檢樣品中提取其核酸(DNAorRNA),并經過精制等復雜的操作(通常稱為前處理操作)之后才可以進行Real-time PCR。不易受反應阻害物的影響,使用時不需要進行復雜的前處理操作,單單需將待檢樣品直接加入到檢測試劑中即可開始檢測。通過使用本產品,可以在更短的時間內,簡便、低成本地進行Real-time PCR檢測。實時熒光定量PCR的定量方法,在Real-time PCR中,模板定量有兩種策略。蘇州組織定量PCR哪家好

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Real-time PCR-傳統定量PCR:1)內參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。2)競爭法:選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。溫州組織PCR檢測技術應用聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應。

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聚合酶鏈式反應準備:PCR引物設計,PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則:引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC很好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

Real-time PCR探針法適用于:1、具有高適應性和可靠性,實驗結果穩定重複性好,特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短,無論怎樣較佳化引物設計條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列,在PCR中容易出現非特異性擴增,對特異性要求較高的定量。6、普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產品的檢驗檢疫,生物製品的鑒定。Real-time PCR探針法:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時,報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離,從而螢光監測系統可接收到螢光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個螢光分子形成,實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。Real-time PCR在實驗過程中為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。

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Real-time PCR實驗常用的RNA酶抑制劑:1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性,從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍:目前被認為是較有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復合物:由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結合形成過渡態類物質,幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結合,使其失活。5.其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。通過使用本產品,可以在更短的時間內,簡便、低成本地進行Real-time PCR檢測。武漢實時Real-time PCR應用

實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。蘇州組織定量PCR哪家好

實時熒光定量PCR:實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。蘇州組織定量PCR哪家好

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