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來源: 發布時間:2022-07-01

聚合酶鏈式反應準備:引物內部不應出現互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列,尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列,否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基,特別是很末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物素、熒光物質、地高辛標記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內,有些很好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚至消失。南京骨頭PCR檢測技術網站

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聚合酶鏈式反應:Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度。在該步驟中,DNA聚合酶通過從反應混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈,在新生(伸長)DNA鏈的末端,將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合。延伸所需的精確時間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴增的DNA目標區域的長度。根據經驗,在很好溫度下,大多數DNA聚合酶每分鐘聚合一千個堿基。在很好條件下(即,如果沒有限制底物或試劑的限制),在每個延伸/延伸步驟中,DNA靶序列的數量加倍。隨著每一個連續的循環,原始模板鏈加上所有新產生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈,導致特定DNA目標區域的指數(幾何)擴增。南京骨頭PCR檢測技術網站逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。

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聚合酶鏈式反應的常見問題:陰性:需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

聚合酶鏈反應:多重連接依賴探針擴增(MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標,從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應:由單個PCR混合物中的多個引物組組成,以產生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因,可以從單次測試中獲得額外的信息,否則將需要幾次試劑和更多時間來執行。每個引物組的退火溫度必須優化,以在單個反應中正確工作,并符合擴增子尺寸。也就是說,當通過凝膠電泳可視化時,它們的堿基對長度應該足夠不同以形成不同的條帶。聚合酶鏈反應是一種非常強大和實用的研究工具。

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聚合酶鏈反應:在檢測病原體方面,病原體培養是臨床診斷的金標準 .但是對于一些苛養菌 生長緩慢的細菌或難以培養的病原體等培養的陽性檢出率不高.檢測時間過長 無法滿足臨床早期快速診斷以指導醫治的需要[3]。當前 PCR 技術是在傳統 PCR 技術應用的基礎上進行的改進,包括實時定量 PCR 技術 、 實時熒光定量PCR、 PCR-酶聯免疫吸附試驗 、 巢式PCR等。 在PCR技術的輔助作用下,實驗室檢測也逐漸從生化免疫診斷過渡到基因診斷,生化免疫檢測主要從表型表現評估病癥,而基因診斷則深入本質探究其病因,以PCR 技術為主的核酸技術在臨床實驗室檢測與疾病診斷中表現出了明顯的應用價值,在未來的臨床醫學檢驗中必將會得到更加較廣的應用。PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。南京骨頭PCR檢測技術網站

聚合酶鏈反應的一個主要限制是,為了產生允許其選擇性擴增的引物,需要關于目標序列的先前信息。南京骨頭PCR檢測技術網站

聚合酶鏈式反應的常見問題:靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。假陽性:出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。出現片狀拖帶或涂抹帶:PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:減少酶量,或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量,減少循環次數。南京骨頭PCR檢測技術網站

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