用富含干細胞的生物墨水打印高保真功能組織

來源：發布時間：2025-07-23

本研究旨在解決傳統水凝膠生物墨水 3D 生物打印后難以快速穩定、分辨率和保真度低的問題，開發了具有剪切變稀和自修復特性的氧化和甲基丙烯酸酯化海藻酸鹽（OMA）生物墨水。該墨水通過鈣離子交聯實現快速自修復穩定，再經光交聯增強力學性能，成功打印出高分辨率（ filament 直徑 223-361μm）、高保真度（92-110%）的復雜結構（如懸垂結構、耳朵模型等）。負載的人骨髓間充質干細胞（hMSCs）存活率高，且在長期培養中可分化為軟骨組織，為復雜功能組織工程提供了有效平臺。

思維導圖

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1. 研究背景與挑戰·

水凝膠的應用基礎：水凝膠是親水性聚合物的 3D 網絡，因生物相容性好、可模擬細胞外基質（ECM），***用于組織工程，但傳統水凝膠難以打印出復雜、高精度的 3D 結構。

· 3D 生物打印的**問題：多數水凝膠生物墨水擠出后無法快速穩定，導致分辨率低、保真度差，難以形成自支撐結構，限制了其在復雜組織構建中的應用。

· 研究目標：開發新型水凝膠生物墨水，需滿足高打印分辨率和保真度、可調力學性能和降解速率、高細胞活力。

2. OMA 生物墨水的制備·

OMA 的合成：通過海藻酸鹽的氧化（使用高碘酸鈉）和甲基丙烯酸酯化（使用 2 - 氨基乙基甲基丙烯酸酯）制備，可調節氧化度（1%、2%）和甲基丙烯酸酯化度（5%、10%、20%）。

· 生物墨水配制：2 w/v% OMA 溶于 DMEM，添加 0.05 w/v% 光引發劑；與不同濃度硫酸鈣 slurry（0-210.0 mg/ml）混合，通過鈣離子交聯形成初始結構，后續可經紫外光（20 mW/cm2，1 min）二次交聯增強穩定性。

3. 3D 生物打印系統與流程

· 打印機改裝：改裝 Printrbot 打印機，替換為注射器泵擠出系統，兼容 Cura 軟件；同時使用商用打印機（Biobot Basic、Bio X?）。

· 打印參數：使用 22G、25G、27G 針頭，通過對應軟件控制，打印結構包括立方體、字母、耳朵、懸垂結構（碗、橋等）。

4. OMA 生物墨水的關鍵性能（流變學特性）

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圖一、由高粘度海藻酸鹽合成的OMA（1OX20MA）生物油墨的表征。OMA生物墨水的粘度測量與（a）剪切力的關系速率和（B）剪應力分別表明了其剪切減薄和剪切屈服行為。（C）OMA-15[OMA+15μl CaSO4（1.22M） ]、（D）OMA-20[OMA+20μl CaSO4（1.22 M）]、（E）OMA-25[OMA+25μl CaSO_4（1.22 M]）和（F）OMA-40[OMA+40μl CaS04（1.22M）]生物墨水表明OMA生物墨水具有機械穩定性。（G）OMA-15、（H）OMA-20、（I）OMA-25和（J）OMA-40生物墨水的應變掃描測試。OMA的G′和G′′交叉生物墨水作為剪切應變的函數，在較高的剪切應變下表現出凝膠到溶膠的轉變。（K）OMA-15、（L）動態應變試驗期間剪切模量的變化OMA-20、（M）OMA-25和（N）OMA-40生物墨水在1 Hz下具有交替的低（1%）和高（100%）應變，表明它們在固體樣之間快速過渡并且在幾秒鐘內表現出類似液體的行為，這表明具有自愈或觸變特性。（O）使用BioX打印機上的OMA生物墨水的3D打印結構（5×5×3 mm）的照片。

5. 3D 打印效果：分辨率與保真度

· 高分辨率：隨針頭內徑減?。?2G：413μm→27G：210μm），打印 filament 直徑相應減?。?61μm→223μm），為針頭內徑的 88-106%。

· 高保真度：10×10×5 mm 立方體打印后，尺寸保真度達 92-110%；復雜結構（UIC 標志、耳朵）及懸垂結構（無需支撐）均能精細打印

6. 細胞活性與功能分化

· 細胞活力：hMSCs 負載濃度為 5×10? cells/ml，打印及光交聯后，Live/Dead 染色顯示高存活率。

· 軟骨分化：在軟骨誘導培養基中培養 4 周后，甲苯胺藍染色呈強陽性（紫色），GAG/DNA 含量***高于對照組（p<0.05），觀察到軟骨陷窩結構，表明形成功能性軟骨組織。

圖二使用改良的Printrbot打印機與由高粘度藻酸鹽合成的負載hMSC的OMA生物墨水區分3D生物打印構建體。代表性的（A）活的、（B）死的和（C）在第0天的光交聯3D打印結構的合并顯微照片。在光交聯之前和之后使用負載hMSC的OMA生物墨水（D）3D打印耳朵。甲苯胺藍O染色前后軟骨分化的3D打印耳朵（F）和（G）。在（H）軟骨生成（Chondro）和（I）生長培養基（對照）中培養的甲苯胺藍O染色構建體切片的顯微照片。（J）3D打印構建體中GAG/DNA的定量。白色、紅色和黑色刻度條分別表示200μm、1 cm和100μm。*與對照組相比，p<0.05。

7. 結論·

OMA 生物墨水憑借剪切變稀、自修復及雙重交聯特性，解決了傳統水凝膠打印的關鍵挑戰，實現高分辨率、高保真復雜結構（包括懸垂結構）的打印。

· 負載的 hMSCs 可存活并分化為功能組織，為組織工程和再生醫學提供了高效、可擴展的平臺。

關鍵問題：

問題：OMA 生物墨水相比傳統水凝膠生物墨水，在 3D 打印中解決了哪些**缺陷？

答案：傳統水凝膠生物墨水存在打印后難以快速穩定、分辨率和保真度低、無法支撐復雜結構（如懸垂結構）的缺陷。OMA 生物墨水通過剪切變稀特性實現順利擠出，快速自修復特性（秒級恢復機械性能）確保打印后立即穩定，雙重交聯（鈣交聯 + 光交聯）增強力學性能，從而實現高分辨率（filament 直徑 223-361μm）、高保真度（92-110%），并能打印無需支撐的懸垂結構，克服了傳統缺陷。

問題：研究中如何驗證 OMA 生物墨水打印結構的功能可行性？

答案：通過干細胞負載與分化實驗驗證功能可行性：① 負載的 hMSCs 在打印及光交聯后存活率高；② 在軟骨誘導培養基中培養 4 周，打印結構保持高保真度，甲苯胺藍染色顯示 GAG 富集（強陽性），觀察到軟骨陷窩結構；③ GAG/DNA 含量***高于對照組（p<0.05），證明 hMSCs 成功分化為功能性軟骨組織，驗證了打印結構的功能可行性。

問題：OMA 生物墨水的雙重交聯機制（鈣交聯 + 光交聯）分別發揮了什么作用？

答案：① 鈣交聯：通過鈣離子與 OMA 的 ionic 作用實現初始交聯，賦予墨水剪切變稀和自修復特性，確保打印過程中順利擠出且打印后快速穩定，維持結構初步形態；② 光交聯：通過紫外光（20 mW/cm2，1 min）引發甲基丙烯酸酯基團聚合，形成共價交聯網絡，增強結構的長期力學穩定性和降解抗性，支持干細胞長期培養和功能分化。兩者結合實現了打印便捷性與結構長效性的平衡。

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