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Recombinant Human FLRT1 Protein

來源: 發布時間:2024-12-03

T7EndonucleaseI(T7EI)在CRISPR/Cas9基因編輯中的應用主要體現在突變體檢測和基因編輯效率評估上。以下是T7EI在CRISPR/Cas9中的具體應用步驟和特點:1.**基因編輯效率評估**:-T7EI用于評估CRISPR-Cas9在給定的導向RNA靶位點上對細胞群體進行基因編輯的效率。-通過PCR擴增圍繞CRISPR導向RNA靶位點的基因組DNA,如果CRISPR-Cas9介導的非同源末端連接(NHEJ)修復事件引入了突變,變性和退火將形成突變型和野生型PCR擴增子的異源雙鏈DNA。2.**突變體檢測**:-如果CRISPR/Cas9編輯成功在DNA上引入突變,則可與野生型DNA片段退火產生異質雙鏈DNA。T7EI可以識別該DNA上的不完全配對的DNA位點然后進行雙鏈切割,通過瓊脂糖凝膠電泳即可顯示酶切后的條帶,從而半定量判定基因編輯效果。-T7EI能識別長度大于或等于2bp的插入、缺失或突變導致的錯配DNA,不能識別1bp的插入、缺失或突變。3.**實驗步驟**:-收集細胞并提取基因組DNA,然后使用PCR擴增期望編輯的基因組區域。擴增子的長度建議為0.5-1kb。-對擴增的DNA進行變性和退火復性,以產生異質雙鏈DNA。-使用T7EI酶處理退火后的DNA產物,在37℃孵育15分鐘。

去泛素化酶可以去除泛素化標記,這一步驟是泛素化過程的逆轉過程,它允許細胞對泛素化事件進行精細調控。Recombinant Human FLRT1 Protein,His Tag

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牛痘DNA拓撲異構酶I(VacciniaVirusDNATopoisomeraseI)在實驗室中的使用主要涉及以下幾個步驟:1.**DNA載體連接**:-牛痘DNA拓撲異構酶I可以用于DNA載體連接,特別是在TOPO克隆載體制備中。它能夠識別并切割雙鏈DNA末端[5’C(T)CCTT],并與DNA形成共價連接形成穩定復合物,遇到DNA的5’-OH基團后,重新連接形成完整DNA鏈。2.**接頭連接**:-在NGS建庫中,牛痘DNA拓撲異構酶I可用于接頭連接。這包括將含有特定序列的接頭A和接頭B與酶一起孵育,以實現DNA片段的連接。3.**操作步驟**:-**質粒解旋**:將超螺旋質粒DNA與牛痘DNA拓撲異構酶I混合,在37°C下孵育5-15分鐘,以實現質粒的解旋。-**接頭連接**:將接頭A(含CCCTT序列)和接頭B(含5’OH)與牛痘DNA拓撲異構酶I混合,在37°C下孵育5-15分鐘,以實現接頭的連接。4.**注意事項**:-雙鏈接頭A通常5’端做NH2封閉修飾,以防止自連接;接頭A的CCCTT后通常包含5-12bp尾巴,再長的尾巴會導致連接效率大幅下降。-雙鏈接頭B的5’端必須包含-OH。-由于該酶應用廣,在不同的實驗中使用策略不同,需要靈活運用,并根據具體文獻進行調整。


Recombinant Cynomolgus BDCA-2 Protein,mFc TagCRISPR/Cas12a 是一種單一的RNA引導的核酸內切酶,通過CRISPR/Cas9系統為靶向基因組工程提供了新的機會。

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在質粒DNA提取過程中,確保DNA的完整性和活性至關重要,這通常涉及以下幾個關鍵因素:1.**溫和的裂解條件**:選擇適當的裂解方法對于保持DNA的完整性至關重要。對于大于15kb的質粒DNA,應采用溫和的裂解方法,如將細菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中,加入溶菌酶和EDTA破壞細胞壁和細胞膜,以減少對質粒DNA的機械剪切力,從而保護其完整性。2.**避免過度裂解**:在質粒提取過程中,并非裂解時間越長越好。過長的裂解時間可能會造成基因組DNA片段的污染,影響質粒的純度。3.**適當的洗滌和洗脫**:在純化過程中,適當的洗滌可以去除蛋白質和其他雜質,但過度洗滌可能會導致DNA的損失。洗脫步驟中,確保洗脫液完全浸潤柱膜,以保證結合在柱膜上的質粒得以充分洗脫,避免因洗脫體積過小而影響質粒得率。4.**避免DNA的降解**:在提取過程中,添加核酸酶抑制劑可以防止DNA被核酸酶降解。同時,避免長時間將DNA暴露在室溫下,以及避免多次凍融循環,這些都有助于保護DNA的完整性。5.**低溫操作**:盡量在低溫條件下進行提取操作,以減少核酸酶的活性,從而保護DNA的完整性。

牛痘DNA拓撲異構酶I(VacciniaVirusDNATopoisomeraseI)是一種來源于牛痘病毒的I型真核拓撲異構酶,具有以下功能和應用:1.**功能**:-牛痘DNA拓撲異構酶I可以催化雙鏈DNA分子中單鏈DNA特定序列位置的磷酸二酯鍵的斷開和連接。-具有解超螺旋的酶(DNARelaxingEnzyme)活性,能夠通過快速的酶切和連接使雙鏈共價閉合環狀的正或負超螺旋DNA發生解超螺旋,形成含有較少的正或負超螺旋的雙鏈環狀DNA分子。-能夠使雙鏈DNA形成繩結(knotting)或解開繩結(unknotting),聯結互補的單鏈環狀DNA成為雙鏈環狀DNA。2.**應用**:-作為一種DNA重組連接的新型工具酶,用于DNA載體和重組片段的連接、缺刻修復、接頭連接等。-適用于TOPO克隆載體的制備、NGS建庫中的接頭連接等。-在TOPO克隆技術中,DNA拓撲異構酶I同時具有限制酶和連接酶特性,其生物學功能是在復制期間切割并重新連接DNA。3.**使用方法**:-用于DNA快速酶切流程,包括配制體系反應液、輕柔混勻、37℃孵育15分鐘等步驟。4.**儲存條件**:-建議在-25~-15℃保存,有效期為3年。5.**注意事項**:-避免起泡或劇烈攪拌、渦旋等操作,以防止酶失活。牛痘DNA拓撲異構酶I因其獨特的功能,在分子生物學研究和基因工程中扮演著重要的角色。FnCas12a在完成特異性切割后,還能非特異性地切割其他單鏈DNA,這一特性被用于開發了多種核酸檢測技術。

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CUT&RUN和ChIC是兩種用于研究蛋白質-DNA相互作用的技術,它們有一些關鍵的區別:1.**技術原理**:-**ChIC(ChromatinImmunocleavage)**:ChIC技術利用抗體將感興趣的蛋白與ProteinA-MNase相結合來進行DNA切割。ChIC的優勢在于使用TF特異性抗體系住MNase,并只在結合位點裂解。-**CUT&RUN(CleavageUnderTargetsandReleaseUsingNuclease)**:CUT&RUN技術則是在核的輕微MNase處理后釋放單核小體和TF-DNA復合物,留下寡核小體。CUT&RUN通過在冰上進行簡短的消化反應,在TF結合的MNase擴散到周邊的基因組和裂解可接近的染色質之前在上清中恢復TF-DNA復合物。2.**操作步驟和簡便性**:-**ChIC**:ChIC可能需要甲醛固定操作,這可能重新引入了ChIP-seq的一些問題,如交聯導致的DNA和蛋白質的化學修飾。-**CUT&RUN**:CUT&RUN簡化了操作步驟,使用磁珠固定細胞核,適用于新鮮和冷凍組織樣本,縮短了生成DNA測序文庫的時間(1-2天)。3.**背景信號和信噪比**:-**ChIC**:ChIC產生的背景信號可能較高,因為它可能涉及到非特異性的DNA切割。

Cpf1是一種新發現的類2/型V CRISPR-Cas DNA內切酶,在不同系統中顯示出一系列的活性。Taq DNA Polymerase

泛素蛋白的C末端通常通過酰胺鍵與靶蛋白的氨基團連接在一起,最常見的是與靶蛋白賴氨酸的ε氨基團相連。Recombinant Human FLRT1 Protein,His Tag

確保Cre重組酶只作用于特定細胞,主要通過以下幾種方式實現:1.**組織特異性啟動子**:-利用組織特異性啟動子控制Cre重組酶的表達,可以確保Cre酶只在特定組織或細胞中表達。這種方法通過將Cre基因置于特定細胞類型特有的啟動子控制之下,實現對Cre酶表達的精確控制。2.**誘導型Cre重組酶系統**:-通過使用Cre-ERT(雌素受體突變體與Cre重組酶的融合蛋白),可以實現對Cre活性的時間控制。在無他莫昔芬誘導時,Cre-ERT與熱激蛋白Hsp90結合,定位于細胞質中;當他莫昔芬給藥誘導時,Hsp90脫離Cre-ERT,使Cre-ERT進入細胞核發揮基因重組的作用。這種系統相當于為Cre-Lox系統加裝了一個由他莫昔芬控制的外源開關,使得體內基因編輯更具時空靈活性。3.**藥物誘導的Cre系統**:-例如Tet-on系統,通過四環素或其衍生物多西環素的添加來激起基因表達。在三重轉基因動物中,rtTA在特定啟動子的控制下表達,多西環素與rtTA結合,Cre的表達,導致固定的報告基因重組。4.**AAV遞送Cre**:-利用包含組織特異性啟動子的腺相關病毒(AAV)載體可以選擇性地將Cre重組酶遞送至特定細胞。


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