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無錫特殊樣本定量PCR方案

來源: 發布時間:2023-08-12

Real-time PCR鏈反應的常見問題分析與解決方法:反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現條帶:試劑,頭,工作臺污染。使用全新的試劑和頭,對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符:污染。使用全新的試劑和頭,對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板?;騺喰?。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法,例如生成雜交探針用于雜交。無錫特殊樣本定量PCR方案

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Real-time PCR-傳統定量PCR:擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,之后酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。寧波分子生物學PCR檢測技術網站所謂Real-time PCR技術,是指在PCR反應體系中加入螢光基團。

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實時定量PCR的系統構成及工作原理:熒光定量檢測系統由實時熒光定量PCR儀,實時熒光定量試劑,通用電腦,自動分析軟件等構成。設備由熒光定量系統和計算機組成,用來監測循環過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正?;幚韥韽浹a背景熒光的差異。正?;罂梢栽O定域值水平,這就是分析熒光數據的水平。

Real-time PCR實驗注意事項-防止RNA酶污染的措施:1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。3.有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1%DEPC水沖洗,晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,然后經0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專業使用實驗室,所有器械等應為專業使用。Real-time PCR在實驗過程中要防止RNA的降解。

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Real-timePCR的反應條件:dNTP濃度過高會加快反應速度,但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增,低則合成產物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能,摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90~95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94~95度30~60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40~60度使引物和模板結合。引物長度在15~25時退火溫度。實時熒光定量PCR實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度。深圳分子生物學PCR檢測技術供應商

PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成,稱為熱循環。無錫特殊樣本定量PCR方案

聚合酶鏈式反應的試驗污染:陽性對照,在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好,經各種鑒定是該產物的標本,如以重組質粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定。無錫特殊樣本定量PCR方案

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