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來源: 發布時間:2023-07-24

引物的設計注意事項:1,引物設計要跨內含子,不能在一個外顯子上(我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的,如果有DNA污染的話,因為DNA上含有分子量很大的內含子,不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用)。2,引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度,方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大,就得分開做,浪費模板,浪費管家基因,所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致,這樣就不用每次查退火溫度,且對整個實驗有利。Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。廣州組織熒光定量PCR網站

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Real-time PCR-傳統定量PCR:1)內參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。2)競爭法:選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。廣州組織熒光定量PCR網站擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段。

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Real-time PCR反應:多重連接依賴探針擴增(MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標,從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應:由單個PCR混合物中的多個引物組組成,以產生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因,可以從單次測試中獲得額外的信息,否則將需要幾次試劑和更多時間來執行。每個引物組的退火溫度必須優化,以在單個反應中正確工作,并符合擴增子尺寸。也就是說,當通過凝膠電泳可視化時,它們的堿基對長度應該足夠不同以形成不同的條帶。

Real-time PCR式反應準備:10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物(終濃度)、引物(終濃度)、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+(終濃度)、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量(或濃度)可根據實驗調整,以上表格只提供大致參考值。PCR反應五要素:參加PCR反應的物質主要有五種即:引物(PCR引物為DN段,細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)。引物有多種設計方法,由PCR在實驗中的目的決定,但基本原則相同。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。

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Real-timePCR的反應條件:dNTP濃度過高會加快反應速度,但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增,低則合成產物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能,摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸,一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。在90~95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94~95度30~60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40~60度使引物和模板結合。引物長度在15~25時退火溫度。在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。杭州細胞熒光定量PCR研究方案

聚合酶鏈反應為這些技術提供了大量的純DNA,有時是單鏈的。廣州組織熒光定量PCR網站

引物的設計對于這個實驗至關重要,因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道,還有幾點必須注意:1,引物的錯配率(引物錯配形成引物二聚體,但是SYBR照樣能嵌入進去,結果導致實驗結果的誤差很大,重復性也不好)。2,引物的特異性一定要高(不像常規PCR,引物同源性不高,只要兩條產物的片段長度相差足夠大,在電泳的時候能夠區分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開,所以這就造成整個實驗結果誤差很大,不可信)。廣州組織熒光定量PCR網站

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