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蘇州細胞熒光定量PCR

來源: 發布時間:2023-06-21

Real-time PCR鏈反應的常見問題分析與解決方法:反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現條帶:試劑,頭,工作臺污染。使用全新的試劑和頭,對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符:污染。使用全新的試劑和頭,對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性。蘇州細胞熒光定量PCR

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Real-time PCR鏈式反應的特點:靈敏度高:PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速:PCR反應用耐高溫的TaqDNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。純度要求低:不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。武漢微量Real-time PCR供應商聚合酶鏈反應的試劑應分配到一次性的等分試樣中。揚州血液Real-time PCRReal-time PCR可看作是生物體外的特殊DNA復制。

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Real-time PCR原理:Real-time PCR主要指在PCR反應體系中加入熒光物質,然后通過熒光化學物質監測每次PCR反應循環后產物總量的方法,之后通過內參法或外參法對待測樣品中的特定DNA序列(目的基因)進行定量分析的方法。實驗過程中,這些熒光物質可以在激發光的作用下釋放出一定波長的發射光,定量用PCR儀通過對這些發射光進行實時監測,較終可以描繪出整個PCR的反應過程,這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈式反應:DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活。

聚合酶鏈式反應的試驗污染:PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性,但令人腦袋不適的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因:標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因組DNA序列是已知的,逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置。Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同,所以對引物的設計要求也不同。

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Real-time PCR實驗常用的RNA酶抑制劑:1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性,從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍:目前被認為是較有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從蛋白中解離出來,又對RNA酶有強烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復合物:由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結合形成過渡態類物質,幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結合,使其失活。5.其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法。溫州分子生物學熒光定量PCR哪家好

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應。蘇州細胞熒光定量PCR

Real-time PCR雙熒光標記探針設計原則:具體的其他要求可以具體聯系設計公司,拿到合成好的引物,需要先確認引物的性能。可以用這對引物先擴增梯度稀釋后的標準品(標準品介紹見后續內容)。由不同梯度標準品的加量和其對應的Ct值,描繪出一條標準曲線。這里要注意根據標準曲線得到的參數是非常重要的。引物性能確認:1.決定系數R2大于0.98,越接近于1,結果越可靠。2.擴增效率一般要求在0.8-1.2,越接近于1,越好。3.檢測的靈敏度,必須確認,通常要求35個循環以內,一般可以得到比較好的定量結果,30個循環以內,沒有非特異性擴增產生。4.NTC是必須要確認的,通常要求30個循環內沒有引物二聚體產生。蘇州細胞熒光定量PCR

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