聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。發(fā)明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術。聚合酶鏈反應的這種能力增強了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。武漢骨頭Real-time PCR技術服務

Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作，一般有三種方法：1、比較復雜的方法：質粒，采用Biotnt提供內參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對目的基因進行Real-time PCR實驗，得到PCR擴增產(chǎn)物；PCR擴增產(chǎn)物轉入質粒中，得到相對定量的標準品；2、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板，3、一般采用的方法：PCR擴增產(chǎn)物，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板，則選用PCR產(chǎn)物作為相對定量的標準品也是可以的；需要注意的事項是：PCR產(chǎn)物濃度很高，而Real-time PCR的產(chǎn)物片段比較短，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作。南通細胞定量PCR在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。

引物的設計注意事項：1，引物設計要跨內含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。2，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。

Real-time PCR鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。Real-time PCR反是一項利用DNA雙鏈復制的原理。

Real-time PCR原理：所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。DNA結合染料法，應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產(chǎn)物。檢測所有雙鏈DNA擴增產(chǎn)物，包括非特異反應產(chǎn)物，如引物二聚體。可對任何雙鏈DNA進行定量；不需要探針，因此減少了實驗設計及運轉成本；適合于大量基因的分析；簡單易用。實時熒光定量PCR：實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。Real-time PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以成為定量的依據(jù)。聚合酶鏈反應允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個。南通細胞定量PCR

實時定量PCR通用電腦，自動分析軟件等構成。武漢骨頭Real-time PCR技術服務

Real-time PCR式反應準備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。武漢骨頭Real-time PCR技術服務

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