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廣州微量Real-time PCR服務

來源: 發布時間:2023-04-04

Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應體系中,加入過量SYBR螢光染料,SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發射螢光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號,從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。此方法適用于:1、靈敏度高:使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上。2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。3、通用型方法,在國內外科研中普遍使用。4、高通量大規模的定量PCR檢測。5、專一性要求不高的定量PCR檢測。Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。廣州微量Real-time PCR服務

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聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應,是一項利用DNA雙鏈復制的原理,在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術,可在短時間內大量擴增目的基因,而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單,廉價和可靠的方法復制DN段,這個概念適用于現物學和相關科學的許多領域。PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫學研究,犯罪取證和分子考古學。通常,PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成,稱為熱循環,每個循環通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應準備:引物內部不應出現互補序列。無錫特殊樣本定量PCR實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限。

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聚合酶鏈式反應準備:PCR引物設計,PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則:引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC很好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

Real-time PCR:1.DNA或RNA的定量分析:Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測,RNAi基因失活率的檢測等;2.基因表達差異分析:例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等),特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶片或差顯結果的確證;3.基因分型:例如SNP檢測,甲基化檢測等。Real-time PCR常用的兩種方法分別為Sybrgreen(螢光染料摻入法)和Taqmanprobe(探針法)。聚合酶鏈反應是是一種簡單,廉價和可靠的方法復制DN段。

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Real-time PCR:基線(baseline):通常是3-15個循環的熒光信號,同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。閾值(threshold):自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置:置于指數擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值:與起始濃度的對數成線性關系,分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導致定量的不準確。相對定量:通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是2-△△Ct。或者是考慮擴增效率的Pfaffl法。因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高,所以相應的對引物設計的要求就很高。徐州分子生物學PCR檢測技術

Real-time PCR探針法具有高適應性和可靠性。廣州微量Real-time PCR服務

Real-time PCR原理:Real-time PCR主要指在PCR反應體系中加入熒光物質,然后通過熒光化學物質監測每次PCR反應循環后產物總量的方法,之后通過內參法或外參法對待測樣品中的特定DNA序列(目的基因)進行定量分析的方法。實驗過程中,這些熒光物質可以在激發光的作用下釋放出一定波長的發射光,定量用PCR儀通過對這些發射光進行實時監測,較終可以描繪出整個PCR的反應過程,這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈式反應:DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,加入設計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活。廣州微量Real-time PCR服務

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