引物的設計注意事項：1，引物設計要跨內含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。2，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決。南通組織熒光定量PCR研究方案

Real-time PCR雙熒光標記探針設計原則：具體的其他要求可以具體聯系設計公司，拿到合成好的引物，需要先確認引物的性能。可以用這對引物先擴增梯度稀釋后的標準品（標準品介紹見后續內容）。由不同梯度標準品的加量和其對應的Ct值，描繪出一條標準曲線。這里要注意根據標準曲線得到的參數是非常重要的。引物性能確認：1.決定系數R2大于0.98，越接近于1，結果越可靠。2.擴增效率一般要求在0.8-1.2，越接近于1，越好。3.檢測的靈敏度，必須確認，通常要求35個循環以內，一般可以得到比較好的定量結果，30個循環以內，沒有非特異性擴增產生。4.NTC是必須要確認的，通常要求30個循環內沒有引物二聚體產生。南通組織熒光定量PCR研究方案聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段。

聚合酶鏈式反應生物學研究的歷史中占據了重要的地位。以此為基礎發展出包括Real-time PCR在內的多項應用技術。自誕生后Real-time PCR技術持續發展，從簡單的增擴到整個PCR過程，Real-time PCR表現出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環增擴曲線的增長。事實并非如此，早期的軟件不能在運行期間提供可視化的增擴曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺較終的數據執行數據分析工作，而不是分析每個單獨的反應循環。對某些設備來說，必須向分析軟件提供實時的數據，有些設備則不需要。前一種設備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴曲線，同時顯示在電腦屏幕上。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產物特異性的情況；目的基因和內參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。Real-time PCR探針法實驗結果穩定重複性好，特異性更高。

Real-time PCR反應：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應:由單個PCR混合物中的多個引物組組成，以產生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因，可以從單次測試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時間來執行。每個引物組的退火溫度必須優化，以在單個反應中正確工作，并符合擴增子尺寸。也就是說，當通過凝膠電泳可視化時，它們的堿基對長度應該足夠不同以形成不同的條帶。Real-time PCR在實驗過程中為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。南京實時Real-time PCR

由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。南通組織熒光定量PCR研究方案

Real-time PCR鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。出現片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環次數。聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。南通組織熒光定量PCR研究方案

上海司鼎生物科技有限公司正式組建于2016-06-07，將通過提供以免疫印跡（WB)技術服務，熒光定量PCR技術服務，膜片鉗電生理技術服務，在體光纖成像記錄技術服務等服務于于一體的組合服務。司鼎生物經營業績遍布國內諸多地區地區，業務布局涵蓋免疫印跡（WB)技術服務，熒光定量PCR技術服務，膜片鉗電生理技術服務，在體光纖成像記錄技術服務等板塊。隨著我們的業務不斷擴展，從免疫印跡（WB)技術服務，熒光定量PCR技術服務，膜片鉗電生理技術服務，在體光纖成像記錄技術服務等到眾多其他領域，已經逐步成長為一個獨特，且具有活力與創新的企業。值得一提的是，司鼎生物致力于為用戶帶去更為定向、專業的醫藥健康一體化解決方案，在有效降低用戶成本的同時，更能憑借科學的技術讓用戶極大限度地挖掘司鼎;OriCell的應用潛能。