所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，之后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)。南通骨頭PCR檢測技術(shù)服務(wù)

引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：1，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子，不能在一個外顯子上（我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來擴(kuò)增的，如果有DNA污染的話，因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴(kuò)增。這對我們消除整個實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用）。2，引物設(shè)計(jì)的時候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫度，方便于以后同時擴(kuò)增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費(fèi)模板，浪費(fèi)管家基因，所以每個實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實(shí)驗(yàn)有利。廈門微量PCR檢測技術(shù)方案實(shí)時熒光定量PCR法較大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差。

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定量分析可以分為定量和相對定量兩種。定量指的是我們想知道某個基因在初始樣品中具體的拷貝數(shù)或濃度是多少？定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。而相對定量是指我們想知道某一個基因在不同樣品中表達(dá)量的差異，其目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。舉例來說，如研究項(xiàng)目中包括使用高鹽脅迫處理的樣本和未高鹽脅迫處理的樣本，記為已處理樣本和未處理樣本，通常可以將未處理樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，用已處理樣本的定量結(jié)果除以未處理樣本的定量結(jié)果，就可以計(jì)算每個已處理樣本的基因含量相對于未處理樣本的百分比。相對定量可以應(yīng)用于差異顯示結(jié)果驗(yàn)證、基因芯片結(jié)果驗(yàn)證、siRNA效果確認(rèn)、mRNA表達(dá)量分析等等。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測定，采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測；以及單位點(diǎn)突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應(yīng)中同時檢測目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時熒光定量在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見”，之后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具。

引物的設(shè)計(jì)對于這個實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，因?yàn)镽eal-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計(jì)的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點(diǎn)必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進(jìn)去，結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差很大，重復(fù)性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大，不可信）。實(shí)時定量PCR通用電腦，自動分析軟件等構(gòu)成。南通骨頭PCR檢測技術(shù)服務(wù)

基于探針的化學(xué)法，Real-time PCR應(yīng)用一個或多個熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。南通骨頭PCR檢測技術(shù)服務(wù)

Real-time PCR鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭，工作臺污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進(jìn)行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進(jìn)行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。基因亞型。對研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。南通骨頭PCR檢測技術(shù)服務(wù)

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