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無錫分子生物學(xué)熒光PCR

來源: 發(fā)布時間:2022-03-04

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):模板的制備,PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì),并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌,可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA,經(jīng)酚、氯仿抽提純化,再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:引物與模板DNA特異正確的結(jié)合。無錫分子生物學(xué)熒光PCR

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗污染:陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗人員心中有數(shù)時,在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括:標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴增,以監(jiān)測試劑是否污染。無錫組織熒光PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):模板的制備,PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

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聚合酶鏈反應(yīng)注意事項:在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂;為了防止非特異性擴增,必須設(shè)陰性對照;內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;PCR不能進(jìn)入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨實驗來確定;防止DNA的污染: 采用DNA酶處理RNA; 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以將缺失、插入或點突變引入DNA序列。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列,尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴增。引物3‘端的堿基,特別是很末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。聚合酶鏈反應(yīng)五要素:參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即:引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。無錫組織熒光PCR

像所有酶一樣,DNA聚合酶也容易出錯,這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。無錫分子生物學(xué)熒光PCR

PCR的反應(yīng)條件:Tm=4(G+c)+(A+T),一般在45~55度,溫度低容易退火但特異性低;溫度高,不容易退火但特異性高。退火時間30秒。延伸溫度一般在70~75度這時TaqDNA聚合酶活性很高(150個/S),當(dāng)引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70~75度的方法,使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當(dāng)〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴增時間。循環(huán)次數(shù)25~30次。無產(chǎn)物時:取10ul擴增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴增;增加TaqDNA聚合酶濃度;增加循環(huán)次數(shù);降低退火溫度;加靶DNA量。無錫分子生物學(xué)熒光PCR

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