無細胞蛋白表達技術(shù)（CFPS）在毒性蛋白和膜蛋白的合成中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。傳統(tǒng)細胞系統(tǒng)難以表達具有細胞毒性的蛋白（如溶菌酶、限制性內(nèi)切酶），而無細胞蛋白表達技術(shù)通過體外開放環(huán)境規(guī)避了宿主細胞存活限制，可高效合成活性毒蛋白，例如珀羅汀生物成功表達的BamHI內(nèi)切酶，其Minimun活性濃度只需0.001μg/μL。此外，無細胞蛋白表達技術(shù)通過添加表面活性劑或脂質(zhì)體模擬膜環(huán)境，實現(xiàn)了全長跨膜蛋白（如CLDN18.1）的可溶表達，純度達80%以上，為藥物靶點開發(fā)提供了關(guān)鍵工具。添加 2 mM 鎂離子可使 ??大腸桿菌體外蛋白表達??產(chǎn)量提高 60%。膜蛋白表達修飾

無細胞蛋白表達技術(shù)（CFPS）雖然具有快速、靈活等優(yōu)勢，但仍存在一些關(guān)鍵缺點。首先，成本較高，商業(yè)化裂解物、能量試劑和酶的價格昂貴，小規(guī)模實驗單次反應(yīng)成本可達數(shù)百元，大規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟性尚未完全解決。其次，蛋白產(chǎn)量較低，反應(yīng)通常在幾小時內(nèi)終止，產(chǎn)量（0.1-1 mg/mL）遠低于細胞表達系統(tǒng)（如大腸桿菌可達10 mg/mL以上）。此外，復(fù)雜蛋白表達受限，原核裂解物缺乏真核翻譯后修飾能力（如糖基化），而真核裂解物成本更高；部分蛋白可能因折疊不完全而喪失活性。技術(shù)操作上，反應(yīng)條件（pH、離子強度等）需精細調(diào)控，且線性DNA模板易降解，增加了實驗難度。CFPS目前更適合小規(guī)模應(yīng)用，在超長蛋白（>100 kDa）表達和工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)方面仍面臨挑戰(zhàn)。未來需通過開發(fā)低成本試劑、優(yōu)化能量再生系統(tǒng)和自動化工藝來突破這些瓶頸。目的蛋白表達protocol不用養(yǎng)細胞，直接拿細胞內(nèi)部的“機器”（核糖體+酶）??在試管里進行蛋白表達??。

盡管體外蛋白表達在科研領(lǐng)域優(yōu)勢明顯，其規(guī)模化應(yīng)用仍面臨三重挑戰(zhàn)：裂解物制備成本高： 真核裂解物（如兔網(wǎng)織紅細胞）的原料獲取與標準化生產(chǎn)難度大，單位成本遠超微生物發(fā)酵；反應(yīng)體系穩(wěn)定性不足： 蛋白酶/核酸酶導(dǎo)致的產(chǎn)物降解及底物（如ATP）快速耗竭限制持續(xù)合成時間；產(chǎn)物濃度天花板： 當前比較好工藝的蛋白產(chǎn)量約5g/L，較CHO細胞系統(tǒng)（>10g/L）存在差距。解決這些瓶頸需開發(fā) 工程化裂解物（如RNase缺陷型菌株）與連續(xù)流灌注技術(shù)，提升經(jīng)濟可行性

無細胞蛋白表達技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如，在COVID-19期間，無細胞蛋白表達技術(shù)被用于數(shù)小時內(nèi)合成病毒抗原，加速疫苗候選物篩選。美國DARPA支持的“生物制造”項目利用凍干無細胞蛋白表達技術(shù)試劑，在戰(zhàn)場環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體，實現(xiàn)便攜式、無需冷鏈的即時生物制造。這類場景凸顯了無細胞蛋白表達技術(shù)在時效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求，無細胞蛋白表達技術(shù)可整合非天然氨基酸（通過修飾tRNA）、脂質(zhì)體（用于膜蛋白表達）或翻譯后修飾酶（如糖基化酶）。??兔網(wǎng)織紅細胞裂解物??（RRL）和??小麥胚芽裂解物??（WGE）是兩類常見真核平臺,用于體外蛋白表達.

在特殊應(yīng)用領(lǐng)域，無細胞蛋白表達技術(shù)CFPS的性價比難以用傳統(tǒng)標準衡量。例如：① 非天然氨基酸標記蛋白（如ADC藥物開發(fā)），細胞系統(tǒng)需基因改造且產(chǎn)量極低，而無細胞蛋白表達技術(shù)CFPS直接添加修飾氨基酸即可實現(xiàn)，單次反應(yīng)成本雖高但省去數(shù)月工程菌構(gòu)建時間；② 便攜式生物制造（如戰(zhàn)場急救蛋白生產(chǎn)），凍干無細胞蛋白表達技術(shù)CFPS試劑可在無冷鏈條件下即時合成，其“按需生產(chǎn)”特性大幅降低倉儲物流成本。這些場景下，無細胞蛋白表達技術(shù)CFPS的技術(shù)獨特性使其成為高性價比解決方案。體外蛋白表達憑借其速度與靈活性的雙重優(yōu)勢，在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)和即時診斷領(lǐng)域持續(xù)釋放價值。植物蛋白表達系統(tǒng)

體外蛋白表達需使用??不含質(zhì)粒骨架的模板??以避免副反應(yīng)。膜蛋白表達修飾

根據(jù)模板設(shè)計，無細胞蛋白表達技術(shù)可分為線性模板和環(huán)狀模板表達。線性模板（如PCR產(chǎn)物）無需克隆，快速啟動表達，但穩(wěn)定性差、產(chǎn)量較低，適用于Batch體系的快速篩選。環(huán)狀模板（如質(zhì)粒DNA）通過克隆技術(shù)制備，穩(wěn)定性高且產(chǎn)量提升，適合CECF體系的大規(guī)模生產(chǎn)（如抗體或抗原制備）。此外，結(jié)合T7/T3/SP6啟動子的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)（如TNT系統(tǒng)）可直接以DNA為模板，簡化流程并提高效率。以上形式可根據(jù)需求組合使用，例如原核CECF系統(tǒng)+環(huán)狀模板用于工業(yè)化生產(chǎn)，或真核Batch系統(tǒng)+線性模板用于快速篩選。膜蛋白表達修飾