隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本的“透明度”得到提高。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡作用

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗。美國雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。

細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi)，促使該細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時去觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細胞。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；

雙光子技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷方面有著巨大的應(yīng)用潛力。這方面沒有標準和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究和龐大的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支撐。通過基于多光子成像技術(shù)研究細胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，可以發(fā)現(xiàn)與細胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、疾病的診斷和特征的關(guān)系。共同探索生理病理基礎(chǔ)和分子細胞生物學(xué)機制，篩選皮膚病、自身免疫性疾病等疑難疾病的識別、診斷和鑒別診斷依據(jù)，建立全新完整的多光子細胞診斷數(shù)據(jù)庫，明確不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備產(chǎn)品標準。在討論環(huán)節(jié)，來自病理科、呼吸中心、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、皮膚科、研究所的多位醫(yī)生和科研人員結(jié)合各自的工作領(lǐng)域，與王愛民副教授進行了熱烈的討論。其中，毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任擬再次邀請王愛民副教授進行學(xué)術(shù)交流。通過此次學(xué)術(shù)交流，病理學(xué)系和研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向。雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具。國外investigator雙光子顯微鏡光損傷

雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監(jiān)測。國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡作用

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡作用