在國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統》的支持下，北京大學分子醫學研究所、信息科學技術學院、動態成像中心、生命科學學院、工學院聯合中國人民醫學科學院組成跨學科團隊，歷經三年多的協同奮戰，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經元和神經突觸活動清晰、穩定的圖像。原始論文于5月29日在線發表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申請多項。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。國外bruker雙光子顯微鏡光毒性

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發時，在波長為350nm光的激發下發出450nm熒光；而在雙光子激發時，可采用750nm的激發光得到450nm熒光。由于雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。進口熒光雙光子顯微鏡供應商雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點：☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；☆漂白區域小：由于激發只存在于交點處，所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊。科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡在生物醫學研究中有廣泛的應用，可以觀察細胞內的亞細胞結構、蛋白質分布、細胞活動等。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術，是熒光顯微成像的一種，用于激發樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發光照射，縱然焦平面外也有激發光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發光波長較長，只有當兩個（或更多）激發光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例。ultima雙光子顯微鏡多少錢

雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；國外bruker雙光子顯微鏡光毒性

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能不斷優化。結合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發激光進入更深的層次，可以從器件優化和標本改造兩個方面入手。關于器件的優化，我們可以把激光束做得更細，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質浸泡標本，使其中的物質(主要是脂質)被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標本的“透明度”。國外bruker雙光子顯微鏡光毒性