利用SYBR Green I可以檢測PCR反應中獲得的全部雙鏈DNA,但是不能區分不同的雙鏈DNA。為了進一步確保熒光檢測的就是靶DNA序列，人們又設計了能與目的DNA序列特異結合的熒光探針，如TaqMan探針。TaqMan探針是一小段被設計成可以與靶DNA序列中間部位結合的單鏈DNA（一般為50-150 bp）,并且該單鏈DNA的5'和3'端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團。這兩個熒光基團由于距離過近，在熒光共振能量轉移（FRET）作用下發生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。PCR反應開始后，隨著雙鏈DNA變性產生單鏈DNA，TaqMan探針結合到與之配對的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐個切除而降解，從而解除熒光淬滅的束縛，熒光基團在激發光下發岀熒光，所產生的熒光強度直接反映了被擴增的靶DNA總量。qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識別差異較小的拷貝數。熒光定量qPCR儀型號

檢測原理：將一個樣本分成幾十到幾萬份，再將其分配到不同的反應單元中，使每個微滴單元包含一個或多個拷貝的核酸分子（即DNA模板），每個單元都會對目標分子進行擴增，檢測PCR擴增產物的熒光信號強度，帶入泊松分布即可計算出起始模板DNA濃度。dPCR原理:微滴式數字PCR檢測流程：其方法與qPCR類似，分為以下幾步。:1、DNA提取2、DNA濃度檢測并稀釋。3、配置PCR反應液。4、上機到PCR儀中進行檢測。5、PCR擴增。6、結果判讀。使用微滴數字PCR儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，計算出DNA濃度。

珠三角小巧qPCR儀使用說明實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

1983年，美國化學家Kary Mullis發明了聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction， PCR)，這一技術將DNA聚合酶的特性結合核酸雙鏈的變性復性特性，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復性，讓目的核酸片段實現了特異性體外擴增，可將極微量的目標DNA特異地擴增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測靈敏度。尤其是耐熱DNA聚合酶的發現，更是極大地促進了PCR技術在分子生物學科研，及臨床分子診斷領域的廣泛應用。常用的 PCR 技術包括逆轉錄PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）和實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）等。

所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。E. 對照組和內參基因的設置：這個是為后面的定量做準備F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。G. 反應體系的設置：A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。

qpcr在擴增每個循環中模板DNA通過變性、復性、延伸三個階段形成更多的子代DNA，為下一個循環提供模板DNA。

定量方法包括相對定量和定量，兩者的重要差異在于相對定量的結果是差異性的結果，涉及比較；而定量的結果是一個具體數值，對于基因表達量而言是基因的拷貝數，不涉及任何比較。相對定量首先需要確定一個內參基因，內參基因作用有檢測樣本材料中RNA是否降解、糾正樣本加樣的差異、校正cDNA合成速率差異及校正PCR抑制劑的影響，其本質作用是利用內參基因的Ct值對目的基因的Ct值進行均一化處理，常用的內參基因包括DH、β-actin、18S rRNA，使用的時候需要注意其序列必須是物種本身的特異序列，雖然其比較保守，但不同物種也會存在堿基差別。另外，相對定量需要確定參照物，因為涉及比較，參照物選擇不同，所得的定量結果可能完全相反，經常選擇的參照物一般是對照組或未處理組。QPCR用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。珠三角小巧qPCR儀使用說明

在進行大量SNP標記分型時無需合成熒光探針和熒光引物。可以的節省實驗成本。熒光定量qPCR儀型號

qPCR的實質就是PCR反應，只是在擴增產物上增加了熒光標記，通過儀器對熒光信號進行采集。熒光信號的強度與擴增得到的dsDNA的濃度成正比，因此非理想條件下的PCR熒光強度Rn=R0+YnRs＝RB+Y0(1+Ex)^nRs （Rn：第n次循環時熒光信號強度，R0：背景信號強度，Rs：每個分子的熒光強度），通過對采集熒光信號就能進行初始模板定量、基因表達量的研究。通過對PCR過程中熒光信號的實時監測，熒光強度的變化趨勢，呈現出一條S型曲線即“擴增曲線（Amplication plot）”，分為四個時期：基線期、指數擴增期、線性增長期、平臺期。熒光定量qPCR儀型號

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