原理：在DNA擴增反應(yīng)中，通過熒光化學(xué)物質(zhì)測定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量。目的：實現(xiàn)定量而不止是定性分析。通過與內(nèi)參基因進行對比，對樣品中的特定基因進行相對表達(dá)量的計算，以實現(xiàn)定量分析。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)被發(fā)明以來，其簡單、可靠、快速、靈敏的質(zhì)量，PCR是分子生物學(xué)中使用的技術(shù)。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復(fù)制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當(dāng)?shù)木彌_體系。PCR 產(chǎn)物的增長形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環(huán)數(shù))。實際中，擴增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當(dāng)然是在PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR 產(chǎn)物（擴增子，amplicon）的量，擴增曲線（擴增子累積曲線），摻錯率，擴增子長度。一般來說，人們關(guān)心的是擴增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù)；擴增子長度，擴增效率，擴增子多少，也加以考慮。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商熒光檢測系統(tǒng)可接收熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號累積和PCR產(chǎn)物形成是同步。

制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。定量DNA——測定目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA水平在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過qPCR，您可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于特定位點。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)需要針對可變性來源進行標(biāo)準(zhǔn)化，包括染色質(zhì)數(shù)量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。兩種常用的標(biāo)準(zhǔn)化 ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)方法——Percent Input法和富集倍數(shù)法（Fold Enrichmen）。與input相關(guān)的ChIP-qPCR數(shù)據(jù)包括ChIP的背景水平和input染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化。建議ChIP 實驗重復(fù)，盡可能將結(jié)果與背景信號和標(biāo)準(zhǔn)誤差一起顯示。

所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：A. 首先是實驗?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。C. 目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。D. 樣品的設(shè)置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。E. 對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準(zhǔn)備F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是95℃15秒，60℃15秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進行反應(yīng)。

qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識別差異較小的拷貝數(shù)。

染料法是指在qPCR反應(yīng)體系中加入一種與雙鏈DNA分子結(jié)合的熒光染料，包括SYBR®Green I、BEBO和LC Green TMI等染料，它們可以與雙鏈DNA（double strands DNA，dsDNA）的小溝非特異性結(jié)合，激發(fā)較強的熒光產(chǎn)生。經(jīng)熒光定量PCR儀器檢測后，對核酸進行定性和定量分析。qPCR 染料法原理:這種方法的優(yōu)點是，需要一對特異性引物，操作簡單、檢測成本低。缺點是由于熒光染料非特異結(jié)合dsDNA產(chǎn)物，無法正確區(qū)分目的產(chǎn)物，尤其是染料結(jié)合引物二聚體易產(chǎn)生錯誤的擴增曲線，易形成誤判。雖然在PCR擴增程序后添加熔解曲線分析，可以方便判斷生成的熒光擴增曲線是否屬于目的產(chǎn)物，但是對于高靈敏度要求的實驗來說，染料法并不是比較好的選擇。與標(biāo)準(zhǔn) PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

PCR 反應(yīng)中通過控制溫度變化使得核酸分子重復(fù)地解鏈與延伸，從而實現(xiàn)對目的片段的指數(shù)擴增。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

Quantagene q225 系列熒光定量PCR 43分鐘完成實驗，再加3分鐘做完熔解曲線需43分鐘即可完成一個40循環(huán)的常規(guī)qpcr實驗。DNA熔解曲線的檢測快可在3分鐘內(nèi)完成。使用快速試劑，30個熱循環(huán)的檢測更可縮短至20分鐘。精密設(shè)計的加熱塊和孔板q225的加熱塊經(jīng)過精密設(shè)計，能夠很大程度地貼合孔板形狀，實現(xiàn)高效的熱傳導(dǎo)，使得在加熱塊達(dá)到預(yù)定溫度后反應(yīng)溶液也能在短時間內(nèi)達(dá)到相同溫度，反應(yīng)溶液溫度更為均一。快速循環(huán)，穩(wěn)定溫度 q225 出色的熱循環(huán)系統(tǒng)設(shè)計使得40 個循環(huán)的常規(guī) qPCR 可以在短短43 分鐘內(nèi)輕松完成，讓您的工作效率獲得質(zhì)的提升。整個實驗過程中溫度穩(wěn)定，不受實驗時間延長而導(dǎo)致的機器內(nèi)部背景溫度上升的影響。深圳單通道qPCR儀供應(yīng)商

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