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重慶二代測序應用

來源: 發布時間:2025-01-19

二代測序的建庫步驟①樣本準備樣本采集:根據研究目的采**適的樣本,如血液、組織、細胞等。例如,在**研究中,可能會采集**組織和對應的正常組織。對于血液樣本,一般采用靜脈穿刺采集外周血,收集在含有抗凝劑(如EDTA)的**管中,以防止血液凝固。組織樣本則需要在合適的條件下盡快處理,以保持核酸的完整性。如果是新鮮組織,可將其置于液氮中速凍,然后保存在-80℃冰箱中。核酸提取:從樣本中提取高質量的DNA或RNA。對于DNA提取,常用的方法有酚-氯仿抽提法和商業化的DNA提取試劑盒。酚-氯仿抽提法是利用酚和氯仿使蛋白質變性,離心后使DNA處于水相,從而實現分離。試劑盒則是基于吸附柱的原理,DNA在特定的緩沖液條件下吸附在硅膠膜上,經過洗滌和洗脫步驟得到純凈的DNA。RNA提取過程中,需要特別注意防止RNA酶的污染,因為RNA酶***存在且很穩定,容易降解RNA。一般會使用含有RNA酶抑制劑的試劑,如焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水來配制試劑,并且操作過程要在無RNA酶的環境中進行,如使用無RNA酶的***頭和離心管。常用的RNA提取方法是Trizol法,Trizol試劑可以同時破碎細胞并使RNA與蛋白質和DNA分離,然后通過氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟得到RNA。二代測序廣泛應用于個性化醫學。重慶二代測序應用

二代測序的建庫步驟②二、片段化處理物理方法:超聲破碎是常用的物理片段化方法。它通過超聲波的高頻振動將核酸分子打斷成合適大小的片段。例如,在一些文庫構建中,將DNA樣本置于超聲破碎儀中,通過調整超聲功率和時間,可以將DNA片段化到幾百堿基對(bp)的長度范圍,一般在150-300bp左右,這符合二代測序的讀長要求。超聲破碎的優點是片段大小比較均勻,但操作需要優化超聲參數,否則可能會導致過度破碎或片段大小不一致。酶切方法:利用限制性內切酶進行片段化。限制性內切酶能夠識別特定的DNA序列,并在這些序列處切割DNA。例如,用EcoRⅠ酶可以識別GAATTC序列并進行切割。通過選擇合適的限制性內切酶組合,可以將DNA切割成期望大小的片段。不過,這種方法的局限性在于酶切位點的限制,可能無法獲得理想的片段大小分布,而且可能會引入酶切偏好性。云南哪里有二代測序提供宏基因組測序也是二代測序。

二代測序用于蛋白組測序面臨的挑戰

數據解讀復雜性:二代測序產生的轉錄組數據量極其龐大,要從中準確挖掘出與蛋白組實際情況緊密相關的有效信息并不容易,需要運用復雜的生物信息學算法和工具進行數據分析、比對、注釋等操作,而且從轉錄組信息到準確推斷蛋白質情況還存在諸多不確定因素,比如可變剪接、翻譯后調控等都會干擾解讀。

定量不準確問題:雖然能通過轉錄組測序推測蛋白表達量趨勢,但這種定量并非直接對蛋白質本身的精確測定,與實際蛋白質的真實含量存在偏差,而且不同樣本間、不同實驗批次間的轉錄組定量數據的穩定性和可比性也有待進一步提升,難以像專門的蛋白定量技術那樣精細反映蛋白量的變化。

二代測序——轉錄組測序的實驗流程(下)測序根據研究需求和預算選擇合適的測序平臺,如Illumina測序平臺。它的測序原理主要是邊合成邊測序(SBS)。在測序過程中,dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)帶有不同顏色的熒光標記,當新的dNTP加入到正在合成的DNA鏈時,通過檢測熒光信號來確定堿基類型,從而讀取cDN**段的序列。測序深度(覆蓋度)也是一個重要參數,一般來說,測序深度越高,檢測到的低表達轉錄本的概率就越大,但成本也會相應增加。數據分析數據質量控制是第一步,要去除低質量的reads(如含有較多不確定堿基“N”的reads)和接頭序列。然后將高質量的reads比對到參考基因組或轉錄組上,常用的比對軟件有TopHat、STAR等。在確定了reads的位置后,就可以計算轉錄本的表達量,常用的方法有RPKM(ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads)、FPKM(FragmentsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedfragments)等。此外,還可以進行差異表達分析,找出在不同樣本條件下(如疾病組和健康組)表達量有***差異的轉錄本,用于后續的功能注釋和通路分析,了解這些轉錄本可能參與的生物學過程和信號通路。denovo測序是二代測序嗎?

二代測序—全外顯子測序的原理是什么?全外顯子測序主要是利用序列捕獲技術,將基因組DNA中的外顯子區域富集起來,然后通過高通量測序技術(如第二代測序技術Illumina測序平臺)對富集后的外顯子DN**段進行測序。其大致步驟包括DNA提取、片段化、文庫構建、外顯子捕獲、測序和數據分析等。例如,在文庫構建過程中,將提取的基因組DN**段化后,在片段兩端連接上特定的接頭序列,這些接頭序列可以用于后續的擴增和測序反應。然后通過與外顯子區域互補的寡核苷酸探針,將外顯子片段從全基因組DNA文庫中“捕獲”出來,經過清洗去除未結合的DN**段后,對捕獲的外顯子文庫進行大規模的平行測序。單細胞測序也是二代測序。云南哪里有二代測序流程

二代測序讀長方面比一代測序短很多。重慶二代測序應用

WES測序

WES測序即全外顯子組測序,是基于二代測序技術的新型基因檢測方法,以下是具體介紹:

原理

人類基因組中*1%-5%的外顯子區域編碼蛋白質,卻包含約85%的致病變異。WES測序通過序列捕獲技術富集外顯子區域DNA,再利用高通量測序技術對其進行測序,***經生物信息學分析和比對,檢測基因突變.

流程

包括DNA片段化和文庫制備、測序和數據分析兩步。先將DNA切割成100-300bp的小片段,以便放入文庫;然后將片段與引物匹配,引物設計靠近外子邊緣以提高捕獲精密度和覆蓋率,經PCR擴增和鏈分析得到測序數據,再對比分析重建原始DNA序列.

優勢

檢測效率高:外子區域占比較小,測序速度快,能更快為患者提供診斷信息.

性價比高:相比全基因組測序,成本較低,且可檢測大量基因突變.

覆蓋度好:可***覆蓋外顯子及醫學相關區域,包括疾病關聯位點和非翻譯區.

變異發現能力強:能發現低頻和罕見突變,為研究復雜疾病和罕見遺傳病提供有力支持. 重慶二代測序應用

標簽: 二代測序
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